生物活性肽具有特殊的生理特性，其在医药和保健食品领域的研究已成为热点。现代科学发展不仅要求能够分离得到具有不同功能的活性肽类，更重要的是能够经过进一步纯化和鉴定得到准确的肽结构、氨基酸序列以及功能通路。

生物活性肽分子质量小但活性显著，主要根据不同的氨基酸的排列顺序而表现出抗氧化、清除自由基、免疫调节、抗癌、抑制病毒等特性[1]。生物体内的活性肽是蛋白质长链经过一定程度的水解之后，将非活性的短肽释放出来，形成的有特殊功能的活性物质[2]。但是，从天然物质中提取活性肽却十分困难，通常每毫克组织中能够有效提取的肽含量很低，又受到原材料来源和分离方法的限制，因此，迫切地需要有效的分离提取、纯化和鉴定的技术来发现和获得更多的生物活性肽。

生物活性肽的制备方法通常有：酶法、微生物发酵法、生物合成法以及基因重组法等。提取纯化的方法有：膜分离技术、层析技术、电泳技术、色谱技术以及探针分离法等；同时还会将多种方法进行联用，以期获得更加单一和结构清晰的活性肽，例如高效液相色谱与质谱联用。利用不同的分离技术获得的生物活性肽均显示出较好的生物学作用。通过小鼠负重游泳试验证明，利用木瓜蛋白酶酶解林蛙油制备的生物活性肽能够有效缓解疲劳[3]。凌敏等[4]研究发现，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌均是碱性蛋白酶的生产菌，但地衣芽孢杆菌比枯草芽孢杆菌具有更强的分泌碱性蛋白酶的能力。通过重组 DNA 实现嗜碱性芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶在地衣芽孢杆菌中的分泌表达，能够提高表达量，并缩短发酵周期。色谱和质谱联用可同时实现单一组分的分离和氨基酸序列的鉴定，在现实中得到广泛应用。Puchalska 等[5]采用高效液相-电喷雾四极杆飞行时间串联质谱技术（HPLC-ESI-Q-TOF）提取到亮氨酰-丝氨酰-脯氨酸、亮氨酰-谷氨酰胺酰-脯氨酸和亮氨酰-精氨酰-脯氨酸 3 种玉米抗压肽。Zhao 等[6]利用超滤和连续色谱分离纯化鹿茸得到4 种具有抗炎作用的活性肽，并用液相色谱串联质谱进行肽结构的鉴定。

随着技术的进步，科研水平的完善以及人类需求的扩大，生物活性肽的制备、纯化和鉴定的方法已不局限于一种或几种方法，而是将多种高效的手段串联起来发挥更全面的作用。但是无论使用何种方法制备得到的肽产物其实是包含杂质的混合物，在进行必要的分离纯化后，得到的产物依然存在糖类、盐类及水分等物质。肽的制备和应用受到多种因素的制约，为得到其中有效组分，各种方法也在不断更新和进步，笔者从健康和高效的角度出发，筛选出制备、纯化和分析生物活性肽的有效方法供大家参考。

1 发酵法制备生物活性肽

制备生物活性肽的方法主要有酶解法、发酵法和定向合成法等几种。酶解法条件温和、快捷、安全、过程易控制。蛋白质经过预处理可提高酶对蛋白质的敏感性，酶解技术可控制酶切位点，保证产物一定的分子质量。其局限性在于必须选择合适的酶和确定所需的时间、温度、pH 等条件[7]。定向合成法包括：液相法、固相法、酶法合成及 DNA 重组等，其中液相法适合小肽合成；DNA 重组使活性肽的产量和纯度提高。但液相法不适合用于反应中间体溶解度低的情况；固相合成限于 40～200 个氨基酸[8]。而发酵法制备活性肽的优势在于生产的活性肽多来源于食品，更安全，可同时利用微生物降低或消除苦味。制备的关键是发酵菌株的选择。

1.1 发酵法的应用原理

微生物发酵工艺根据底物的不同分为液态发酵和固态发酵两种，其基本原理是利用菌种在其代谢过程中产生的蛋白酶，将活性肽片段从底物蛋白中水解出来，实现对发酵产品的分离纯化[9]。

固态发酵是先选择合适的菌种进行扩大培养后得到产量大、活性好、抗杂菌能力强的发酵基团。将经过灭菌和调制的预处理原料与发酵基团混合，进入发酵生产过程。固态发酵是需氧发酵，物料厚度要适当和均匀，保证通风透气；而且发酵的过程中会产生热量，需要经常翻动来蒸发水分。固态发酵的不足之处在于发酵过程需要接触外界空气，容易受到杂菌的污染。因此需根据不同菌种的特性，提供足够的营养和条件，使菌母形成绝对的生长优势，从而抑制杂菌。曹亚兰[10]分别利用固态发酵和酶解偶联制备大豆抗氧化活性肽，结果证明发酵法制备的大豆肽比酶解法制备的肽具有更高的抗氧化能力。许芳等[11]利用混合菌类固态发酵水解脱脂大豆粉制备活性肽，水解度可达到 90.61%。